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流动相中气体形成的原理及脱气方法

发布时间:2022-08-02 22:01
信息摘要:
广东信一检测技术股份有限公司是经国家认可委认可,具有中国合格评定国家认可委员会CNAS认可资质和计量认证CMA资质,为客户提供一站式检测服务及绿色解决方案的综合性第三方检测公司。 商用高效液相色谱系统

广东信一检测技术股份有限公司是经国家认可委认可,具有中国合格评定国家认可委员会CNAS认可资质和计量认证CMA资质,为客户提供一站式检测服务及绿色解决方案的综合性第三方检测公司。

商用高效液相色谱系统已有40多年的历史。在此期间,出现了各种各样的技术进步,如高精度低流量蠕动泵、具有良好再现性的进样器和能够进行高灵敏度检测的各种类型的探测器。然而,因此,化学因素在决定高灵敏度分析或自动连续分析是否具有高可靠性方面变得越来越重要。例如,这包括诸如样品组分的吸附和稳定性,流动相(或洗脱液)的选择,或在制备过程中解决重现性问题等因素。现在还需要关注流动相中的溶解空气水平如何影响探测器基线稳定性或探测灵敏度。在流动相中调整溶解空气的水平可视为流动相脱气问题。因此,这篇专题文章通过从理论原理到实际实践的一系列问题,将重点放在了流动相的脱气问题上。我希望本文将有助于您选择和使用适合的脱气方法。

  1.由于流动相中的空气可能发生的各种问题

  为了再次强调流动相脱气的重要性,下面的例子展示了由于流动相中的空气而可能发生的问题。这些问题可以通过适当的脱气来解决。

  这些问题大致可以分为与气泡形成有关的问题和与溶解空气有关的问题,没有气泡形成。

  我们还收到了关于溶解氧引起问题的报告,例如样品组分、流动相中的化合物和固相的氧化,但遗憾的是,这种讨论不在本文的讨论范围之内。

  2.气泡产生的机理

  现在,让我们来确认气泡是如何形成的。当溶液中溶解的空气量超过饱和溶解度时,就会形成气泡。饱和溶解度是当溶液暴露在空气中,进入和离开溶液的空气处于平衡状态时,最终溶解在溶液中的空气量。然而,这个量取决于溶液的类型、气体的类型、温度和压力。

  因此,科学地讲,这是用这样的方式表示“鉴于氧气接触水的分压在25℃是0.2个大气压,氧的饱和溶解度在25℃和一个大气压下是1毫升的水含有0.006毫升氧气。”

  如果溶解的气体超过饱和溶解度,则称为过饱和,在振动或搅拌时容易产生气泡。相反,在饱和溶解度水平以下,空气很容易溶解到溶液中,但这种溶解速度不是很快。

  2-1)升高溶液温度

  在某些情况下,例如,当一种因储存而变冷的溶剂被放在一个温暖的房间里时,气体的饱和溶解度随着温度的升高而逐渐降低,导致过量的溶解气体形成气泡。这是同样的原理,当软饮料在打开之前加热时,二氧化碳气体(CO2)会更剧烈地形成。

  图2显示了在某一大气压下,O2和N2相对于水的饱和溶解度曲线。由于实际空气中含有20%的O2和78%的N2,如果暴露在空气中,溶解的O2和N2分别是所示水平的0.2或0.8倍左右。

  2-2)减少压力

  一般来说,气体压力(分压)越高,气体溶入液体的程度就越高(图3)。相反,如果在高压下溶解了饱和的气体,当压力降低时,气泡就会形成。

  2-3) 溶剂混合

  气体的饱和溶解度因液体的种类而异。通常,极性较低的气体在极性较低的溶剂中更容易溶解。图4显示,苯和甲醇每体积溶解的气体大致相同。如果用每摩尔溶剂的溶解量,也就是摩尔分数来计算,很明显,溶剂的极性越低,溶解速率越高。

  如果不同的溶剂混合,那么饱和溶解度会发生什么变化?答案是,一般来说,混合溶液中溶解的量小于单个溶剂中溶解量的总和。图5显示了水和乙醇的混合物(在1大气压下)中溶解的O2的数量。点A表示100%水中溶解O2的量,点B表示100%乙醇中溶解O2的量。当混合等量的水和乙醇时,溶液中含有与点C相对应的O2,但该溶液的饱和溶解度仅在点D处,因此,点C与点D之间的O2的差值为气泡。水/甲醇和水/乙腈混合物的饱和溶解度也是如此。

  如果混合的两种溶剂都是水,甚至也会产生气泡。这是因为空气的饱和溶解度通常随盐浓度的增加而降低。然而,这种关系不是线性的,而是向下弯曲的。

  3. 在流路中形成气泡的问题

  3-1) 由于流动相瓶内产生气泡而引起的溶剂输送问题

  现在,让我们通过在第1节中介绍的,第2节中机理的描述重新考虑流动管道中气泡形成的问题。

  如果在流动相瓶中形成气泡,则表明流动相已被溶解空气过饱和。例如,这可能是由以下原因引起的:

  (1)液体温度升高

  当使用从储存中取出的冷溶剂并立即放入流动相瓶时,或者在早上装配流动相,但中午室温升高时,就会发生这种情况。

  (2)溶剂混合物的混合不足

  特别是水与乙腈混合时的吸热反应会降低溶液温度。因此,即使溶液完全混合以除去任何过饱和的空气,如果被室温加热并使其温度升高,气泡仍然会发生。

  如果这些气泡通过吸入过滤器吸进泵头,溶剂将不能再正常输送。首先,当气泡上升时,泵头内部较低的压力导致气泡膨胀(图7)。当这种情况发生时,柱塞测量溶剂的体积和膨胀气泡的体积。接下来,当溶剂被喷出时,头部内部的高压会收缩气泡。这意味着比正常量的流动相的输送要少。这样,如果允许气泡不受限制地流过泵头,流动相的输送量也将不受限制(溶剂输送准确度和精密度较差)。这种现象的存在可以通过监测(图8)溶剂输送泵的流出压力曲线来确定。如果出现这种类型的问题,保留时间和峰值面积的变异性会增加(图9),分析结果没有充分的可靠性。

  3-2) 因泵内产生气泡导致溶剂输送发生故障

  即使流动相瓶中溶解的空气低于饱和溶解度水平,当溶液通过泵时仍会形成气泡。

  (1)低压梯度混合:当不同的溶剂在常压下(或稍低的压力下)混合时,由2-3所述的机理,图10中红色圆圈区域会形成气泡。无论梯度混合器安装在泵下游(高压侧)多远,混合将在红色圆圈区域开始,这在一定程度将导致的气泡形成。相反,在高压梯度混合中,从泵下游(高压侧)开始混合,所以不会出现这种问题。

  (2) 吸滤器堵塞:如果吸入过滤器堵塞,在吸入过程中阻力增加,增加了由于过滤器内压力下降而形成气泡的可能性。当过滤器闲置时,杂质附着在过滤器上,或者甲醇通过过滤器时,没有意识到之前的流动相是缓冲溶液时,就会发生堵塞。如果堵塞的程度很轻,可以通过适当地去除流动相中的气体来防止气泡,但实际上应该通过清洗或更换过滤器来解决这个问题。

  这些因素引起的问题与3-1中描述的一样。

  如何清洗吸滤器

  如果吸入过滤器被不溶物或碎片堵塞,尝试用超声波清洗机反流冲洗,如图11所示。如果化合物沉淀堵塞,清洗过滤器通过切换清洗解决方案,从水到溶液A,到异丙醇、氯仿(A是稀氨水/甲醇溶液的酸性有机化合物或稀释水磷酸/甲醇溶液的碱性有机化合物)。另外,使用泵彻底清洗(图12)。即使清洗后,如果在快速流动过程中吸入管中出现气泡,也要更换过滤器。

  请注意,稀硝酸溶液(不要让它接触酒精)经常用作金属颗粒的洗涤溶液,而EDTA-2Na溶液经常用于金属离子,SDS溶液经常用于蛋白质。

  3-3) 由于气泡在柱内形成或聚集而形成的沟道

  由于压力的增加,增加了空气的饱和溶解度,气泡往往不会在柱内出现。然而,如果用柱温箱加热,在柱出口附近相对较低的压力区域会形成气泡。气泡通过泵后也有可能聚集在这个区域。

  这种情况会导致柱中的流动相流动发生变化,导致峰结果失真。

  注意,柱直径越大,气泡出柱的难度越大。因此,如果在高效液相色谱系统上附加了一个预备柱,则安装该柱,使进气口尽可能高,出气口尽可能低,以尽量减少因克服浮力而产生的气泡。

  3-4) 检测池内气泡形成或聚集引起的基线噪声

  如果对柱或检测器单元加热,气泡更容易形成,因为通过检测池的溶液温度升高,压力接近大气压。此外,气泡可以在梯度系统中形成,甚至不需要加热。第2-3节描述了溶剂混合时饱和溶解度如何降低。例如,在高压梯度混合的情况下,混合后的流线保持在高压下,这抑制了气泡的形成,但气泡可以在压力接近大气压的单元中形成。

  检测器池中气泡的形成或积累可能导致尖刺和锯齿噪声,或导致基线波动超出范围。因此,它可以防止峰和噪声的区分,导致基线位置的不确定性,并防止峰被正确地积分。

  在3-3)和3-4)中描述的情况下,如果使用紫外线或电导检测器,电池的抗压性很高(12mpa和3mpa)。因此,可以通过对检测器出口施加反压力并增加柱出口和单元内的压力来防止气泡的形成。通常情况下,背压采用2米长的不锈钢管,内径0.3毫米,作为流量限制器连接。当水或甲醇以1mL /min的速度流过节流器时,分别会产生0.2 MPa和0.1 MPa的压力。不同溶剂压力不同的原因是溶剂粘度不同,其影响如下式所示。

  (压力)∝(溶剂粘度)(流量)(管长度)(层流通过管提供了持续的内部直径)

  如果在制备流量下使用,同样的节流管会施加过多的压力。在这种情况下,必须使用较短的管或内径较大的管(例如0.8毫米)。另一方面,对于半微LC或其他低流量应用(例如0.1 mL/min),相同的节流管施加的压力太小。因此,这需要切换到一个能够更容易施加反压力的管子,例如一个6米长的内径0.2毫米的管子。

  然而,由于流通池的低压阻力,反压不能应用于电化学检测器。在这种情况下,溶解的空气必须事先从流动相中除气。

  根据流动线中气泡形成的问题,讨论了温度升高、压力降低、混合溶剂等关键因素。图15显示了流线、压力和温度之间关系的示例。请使用它来评估系统的哪个区域最有可能产生气泡。

  4 .溶解空气(氧)对检测的有害影响

  通过检查气泡产生压力的波动、气泡基线的特征噪声等,很容易发现气泡形成的相关问题。然而,一个难以注意到的更麻烦的问题是不形成气泡的溶解空气的有害影响。

  4-1) 高浓度的溶解氧对检测结果有不利影响

  在所有溶解气体中,氧对检测的影响最大。溶解氧在不同的压力/温度条件下,甚至在低于饱和溶解度的水平下,都能在探测器流通池内部引起各种各样的问题。

  i)荧光检测器:当溶解氧水平较高时,对某些荧光成分如芘、萘和其他多环芳烃或生育酚(维生素E)的检测响应会降低(O2猝灭)。在实际应用中,溶剂背景浓度也有所下降,但响应下降幅度较大。例如,除去溶解氧后,萘的响应大约是响应的1/4。

  ii) 电化学检测器:特别是如果测量值低于还原电位,高水平的溶解氧会产生不利于S/N比的还原电流。

  4-2) 高浓度或不断变化的溶解氧对紫外线检测的有害影响

  对于一些有机溶剂,如果溶解氧水平高,吸光度明显增加。相反地,它意味着脱气可以降低由于吸收流动相引起的背景的水平。例如,如果用溶解饱和空气(其中氧的分压为0.2大气压)的甲醇作为流动相,并在210 nm处测量,与通过氦气净化除空气后相比,背景可以减少超过0.32 AU(图16)。因此,如果溶解氧水平高,不用说噪音水平高,但如果移动相温变化或其他因素可以改变溶解氧水平,基线波动也会增加。如果测量范围为0.01 AU,溶解氧的1%变化会导致基线变化超过30%。与溶解氧水平高的甲醇梯度混合会增加基线斜率(图17),可能会出现积分问题。

  溶解氧的这种作用在短波长的区域是显著的,但是已经证实对四氢呋喃(THF)可以延伸到相对长的波长。在254nm处的相对效应用不等式THF >甲醇>乙腈>水表示。相比之下,这种效应对于乙腈(色谱级)即使在短波长的情况下也不会出现。因此,吸光度的增加似乎不是由于氧气本身的吸收,而是由于氧气与溶剂或溶剂中的杂质之间某种独特的相互作用。

  一般来说,色谱级乙腈应用于短紫外波长区域的高灵敏度分析。然而,如果由于分离选择性而必须使用甲醇或四氢呋喃,则将溶液脱气以降低溶解氧水平,并使其保持在恒定水平。

  4-3)由于溶解空气含量的变化,折光仪基线的波动

  液体的折射率不仅取决于固体和液体的溶解,也取决于气体的溶解。因此,由于液体温度的变化,导致空气溶解度的变化会使得折光仪基线漂移或波动。如果测量与四氢呋喃作为流动相,8×10 -6 RIU的满量程范围,溶解氧变化1%,基线变化超过10%的满量程范围。适当的纠正措施包括通过保持流动相温度恒定来抑制溶解变化,或者用氦净化空气,氦的溶解水平与温度的关系最小。

  如上文第4节所述,在进行分析时,请记住溶解空气(氧)对检测可能产生的有害影响。

  5.脱气方法

  到上一节为止,我们展示了需要对流动相进行脱气的示例,但本节讨论了用于除气的方法。脱气有两种基本方法:离线脱气和在线脱气。

  离线脱气在将流动相置于泵进口之前,先将其除气。然而,流动相一旦被放置在泵入口,就开始重新溶解空气,因此彻底脱气几乎没有意义。相比之下,在在线除气中,即使在分析过程中也会继续除气。它的处理有点耗时,但在提高分析的可靠性方面更有效。每种方法都有其优缺点,如下所示。

  5-1) 加热搅拌(1)

  通过加热搅拌,将流动相瓶中溶解的空气降低到饱和溶解度水平。如果储存过程中使用的是冷溶剂,而且在分析过程中温度预计会从早上上升到中午,或者水和乙腈混合,那么稍微加热一下就会使其更快达到平衡。当液体温度较低时,液体密度会不同(增加),这也会影响溶剂的输送。消除这种效应也是加热搅拌的目的之一。

  无论是使用气液分离膜在线脱气,还是通过氦气净化脱气,提前完成这个过程都是可取的。

  程序

  将流动相瓶放在比室温稍微暖和一点的水浴中,盖子松开。偶尔打开瓶盖,固定瓶盖,摇匀,然后松开瓶盖释放多余的气体。这与减压分离漏斗完全相同。当瓶子温度略高于室温时,这个过程就完成了。擦拭瓶壁并将其放在泵进口处。

  优点

  -该工艺简单,无需特殊设备。

  缺点

  -除气只有在达到饱和溶解度水平时才能进行,因此不能用于低压梯度或其他一些高灵敏度检测方法。

  -如果过热,过度的脱气会在分析过程中由于空气重新溶解而引起基线漂移。

  应用

  -用紫外、折射或荧光检测进行正常灵敏度的分析。但是,如果使用柱温箱、检测器单元加热或高压梯度,则必须对检测器施加反压力。请注意,最好保持移动相瓶抬高或额外使用一个气泡陷阱,如后5-6)。

  5-2) 使用脱气器进行真空除气

  这种方法也可以用来快速去除多余溶解的空气。

  程序

  将抽滤器连接到移动相瓶口上,并通过使用超声波清洗机振动瓶或搅动流动相的方式吸气。当小气泡的剧烈起泡停止时,这个过程就结束了。如果吸入太多,大气泡形成或流动相沸腾。在吸入过程中,由于与液体接触的气体越来越多是流动相蒸发(由于空气的分压接近于零),溶解空气的含量很容易在饱和溶解度水平以下脱气。另一方面,如果把瓶子放在泵入口,与液体接触的气体逐渐被空气所取代,空气开始重新溶解。同时,在吸气过程中,流动相汽化的热量丢失,容易冷却。在这种情况下,瓶子放置在泵入口后溶液温度升高,与前面描述的相反,饱和溶解度可能降低。

  优点

  -快速脱气

  缺点

  -过低的压力会改变溶剂的组成。

  -折光计和一些紫外检测器的基线容易漂移

  应用

  -使用紫外或荧光检测的正常灵敏度分析。但是,如果使用柱温箱、检测器流通池加热或高压梯度,则必须对检测器施加反压力。

  -由于液体温度变化或溶剂成分变化的可能性,不适合进行高精度分析。

  -如果使用电导检测或电化学检测,仅以水为流动相溶剂,在饱和溶解度水平以下过度脱气,可以进行数小时的分析。

  5-3) 加热搅拌(2)

  这种方法采用在线加热。由于它可以将流动相加热到与柱或检测器流通池相同的温度,如果提供了具有固定成分的溶剂,就不会形成气泡,折光计基线就会稳定。流动相温度越高,除气能力越高,但要求防止沸腾气泡进入吸滤器,加热或控制吸入管和泵头温度。

  程序

  将冷凝器连接到专用的储液瓶上,并将其置于热搅拌器上。为了改善温度控制,应该使用暖水浴。

  优点

  -空气溶解的水平非常稳定

  缺点

  -设备体积庞大,需要一个带有专用止水器和水线的移动相瓶。

  -对于溶剂混合物,溶剂混合比误差可能发生在制备和输送阶段之间。

  -稳定需要时间

  -运营成本高

  应用

  -使用折光计、电导检测或电化学检测器进行高灵敏度分析。

  -适用于高温加热时使用紫外线或荧光检测进行高灵敏度分析。

  5-4)使用气液分离膜进行真空脱气

  这种脱气装置安装在流动相瓶和溶剂输送泵之间,用途广泛,一般称为脱气单元。这些脱气单元在树脂膜管外部保持真空压力,并利用膜的渗透性从流动相溶液中去除较小的分子,如氧和氮。因为它们能够去除大约70%-95%的空气,它们能够防止在流线中产生气泡的问题,甚至适合梯度洗脱,它们适合于某些高灵敏度的检测方法。

  程序

  将脱气单元连接到流动相瓶和输送泵。通过泵排泄,排出树脂膜管容量的2-3倍(型号DGU-3A/4A每跟管路约15 mL,型号DGU-12A/14A每跟管路约10 mL,型号DGU-12AM/14AM每跟管路约2mL)。另一种方法是,当废水被排干时,用抽吸滤器将气泡吸出液体表面约5秒钟,然后等待气泡排干。气泡停止排放后,继续排放约10 mL,然后完成流动相置换。

  优点

  -不限制流动相瓶形状或瓶塞(其他在线除气方法有限制)。

  -流动相混合物的组成不太可能改变。

  -运营成本低。

  -处理是容易的。

  缺点

  -脱气能力取决于流量。*1

  -真空泵开启或关闭时,脱气能力不同。*2

  *1:

  脱气能力随流量的增大而减小。因此,如果在210nm监测100%甲醇流动相,当流量增加时吸光度会增加(图23,使用型号DGU-3A/4A)。在水/甲醇高压线性梯度分析中,基线吸光度的变化为一条曲线(图24)。

  *2:

  有三种类型的脱气单元-(1)带有真空泵的模块,并以恒定的转速旋转,(2)带有真空泵的模块,当真空室内的真空度达到一定水平后关闭真空泵,然后自动启动当真空度降低时,和(3)带有真空泵的模块,真空泵在很小的固定间隔里进行开关。类型(1)的型号需要很长时间才能稳定下来,而且不会卖出太多。到目前为止,很多型号都是类型(2) (DGU-3A/4A)。在某些情况下,(2)型脱气装置可在210 nm处用于甲醇紫外检测或254 nm处用于THF折光计检测中引起基线波动(图25)。近年来,出现了类型(3)模型(DGU-12A/14A),其波动小得多。对于折光计,有时可以通过串联脱气装置的多条流线来减少波动(图26)。

  应用

  -采用低压或高压梯度混合的高精度(保留时间的重现性)分析

  -使用荧光检测、电导检测或电化学检测的高灵敏度分析

  -利用紫外线检测进行高灵敏度分析。但是,如果使用溶解氧水平波动显著影响吸光度的流动相,这种方法就不适用。

  -用折光检测器进行的常规灵敏度分析。

  5-5) 通过氦气脱气

  将氦气通入流动相会使氦溶解并取代溶解的空气。如图27所示,氦在各溶剂中的溶解度普遍较低,且受温度影响较小,如图28所示。因此,它不仅有助于在紫外线和荧光检测(这是受溶解氧的高度影响)而且有助于折射计检测器的情况下获得高灵敏度稳定的基线。这种方法被称为氦吹扫法、氦气鼓泡法或喷雾法。

  然而,即使流动相瓶被氦气吹扫,如果瓶子被放在空气中,它也会引起额外的基线不稳定性。原因是与液体接触的气体总是含有空气,所以不可能完全排除空气。此外,改变氦气流量也会导致空气的分压波动,从而导致基线漂移。因此,当用氦气吹气时,最好使用密封加压系统。

  程序

  密封加压氦气吹扫需要如图29所示的流线配置。其中一个关键点是流动相瓶的专用密封帽(包括DGU-10A等型号的标准)。首先,首先将氦气提高流量(例如,通过压力将其调整为0.02至0.05 MPa或0.2至0.5 kgfcm-2),保持10至30分钟,以清除流动相中的空气。接下来,关闭排气阀门,对与液体接触的气体稍微加压。这时候,流动相已经准备好可以进行分析。然后,提供足够的氦气来补偿泵输送流动相中的液滴。

  分析完成后,打开放气阀,将压力调节阀调零或关闭阀门(如果有的话)。由于氦气逐渐从氦气管中逸出(这使得空气难以进入管内并在管内产生真空压力),有时流动相可以回流出氦气过滤器。如果节流管在装置内部有泄漏,这个问题可以通过空气回流来避免。如果不可用,通过松开氦气输出管和装置之间的连接来引入空气。

  当调节阀失效或压力设置过高时,装置中的安全阀可以让氦气逸出,以防止流动相瓶内的压力过大。当然,为了最大限度的安全,流动相瓶应该用塑料片或网包装(图30)。(DGU-10A型号的标准型号包括塑料片和网。)

  溶剂气体疏水阀用于防止挥发性溶剂蒸汽扩散到室内。然而,对于没有密封和加压的氦气净化系统,它们也可以在保持气体与液体接近恒定压力下保持接触的情况下发挥作用。

  优点

  -显示出最佳的除气能力。

  -除气能力不依赖于溶剂输送流量。

  缺点

  -需要一个氦气瓶,调节器和气体管路。

  -除非使用密封加压系统,否则可能无法维持稳定的基线。因此,流动相瓶的尺寸和形状都有限制。

  -对含有挥发性溶剂的流动相进行脱气时可以改变溶剂的组成。(使用密封加压系统使系统稳定后,不太可能发生成分变化。)

  应用

  -高灵敏度的紫外线和所有其他检测方法的分析(给定一个密封加压系统)。(对于开放系统,氦吹扫可用于荧光、电导率或电化学检测的高灵敏度分析。)

  -使用低压或高压梯度混合的分析(如果将单一溶剂放入单个流动相瓶中,则可以进行高精度分析)。

  5-6) 无脱气方法

  虽然它们不是脱气方法,但将流动相瓶放置得更高,并安装一个气泡阱,可能会减少气泡流入溶剂输送泵。

  提升流动相瓶

  将流动相瓶抬高至溶剂输送泵之上,如图31所示。这对泵进口施加一点压力,可以减少内回流止回阀的故障(如果回流止回阀正常工作,则与此无关),在一定程度上压缩进入泵进口的任何气泡,并提供其他好处。浮力也使吸入管中的小气泡更难进入泵内。

  由于提高流动相瓶有很多好处,我们建议提高流动相的放置位置即使使用在线脱气单元。

  气泡捕捉器

  在流动相瓶和溶剂输送泵之间可安装气泡捕捉器(图32和33),防止气泡通过吸入管进入溶剂输送泵。要将流动相引入疏水阀(从疏水阀中吸出气泡),并将注射器连接到注射器端口。

  这种方法的缺点包括(1)更换流动相需要时间(需要至少10到20次的内部体积液体通过捕捉器),(2)它不能用于在入口进行低压梯度混合的系统(因为它阻止创建适当的梯度),和其他因素。因此,如果使用在线除气装置,使用捕捉器是没有意义的。

  6.特定分析条件的应对措施

  前几节讨论了特定流动相除气方法的特点和应用。本节根据分析条件来考虑脱气。一般来说,对于灵敏度正常水平的通过加热搅拌(5-1中描述)和提升流动相(5-6中描述)通常是足够的,但在许多情况下,例如如果检测条件不同或如果需要稳定的高灵敏度基线,就必须要考虑在线脱气或其他非脱气措施。

  6-1) 在反相色谱柱和紫外短波长条件下如何获得高灵敏度的基线

  利用ODS或其他反相色谱柱使用紫外检测器进行检测是HPLC分析中最常用的组合。但是,要实现短波长区域内的高灵敏度检测,必须考虑以下几点。

  (1)彻底冲洗高效液相色谱的流路和色谱柱

  简单地用流动相冲洗一天是浪费时间。一种更有效的冲洗方法是对被冲洗的特定物质使用溶解性高于流动相的冲洗溶液。例如,要冲洗油基物质或高度疏水的中性物质,可以试试四氢呋喃。对于吸附在硅胶表面的物质,使用0.01%含甲醇/0.5 M高氯酸钠(1:4)的磷酸水溶液。对于金属离子,使用0.1%的EDTA-2Na水溶液(不通过柱)。通过多次切换每个阀门的位置冲洗管路开关阀,包括进样器。以及冲洗吸入过滤器。

  对于其他高灵敏度分析,也应考虑流线和柱冲洗措施。

  (2)使用低背景水平的试剂作为流动相

  图34-36为乙腈、甲醇和THF试剂的吸收光谱,这些试剂通常用于反相柱的流动相。结果表明,色谱级乙腈在短波长区背景电平最低。而甲醇和THF试剂的背景水平较高,会增加噪声,背景水平随着溶解氧水平的变化而变化。因此,它们不适合进行高灵敏度分析。根据溶剂类型的不同,分离选择性和峰形也会有所不同,但如果稳定性不太好,应使用色谱级乙腈。

  此外,使用乙酸或其他有机酸作为缓冲溶液或使用胺基吸附抑制剂,如三乙胺,可以增加背景水平。缓冲溶液采用磷酸钠溶液(吸附抑制剂采用高氯酸钠溶液),必要时只制备必要数量的流动相。当然,对于水,使用色谱级蒸馏水。

  (3)使用高灵敏度的检测器

  显然,在市面上的LC检测器中,使用的是噪音水平越低越好。

  (4)在线脱气

  即使使用色谱级乙腈,密封加压氦气净化系统或其他类型的在线脱气系统也可以提供轻微的背景水平降低。

  我们前面只指出了四点,是按重要性排序的,但实际上,最常见的是(1)和(2)两点不满足适当的条件。因此,也要考虑分析条件。

  (色谱级蒸馏水分别用于空气饱和和对照。)

  6-2) 如何使糖分析柱和折光计获得高灵敏度的基线

  尽管紫外检测得到了广泛的应用,但折射计通常用于糖分析和GPC(或SEC  -体积排阻色谱)。一般认为折射计的基线稳定性较差,但真正的罪魁祸首往往是流动相中溶解空气或柱温度变化。

  i)配体交换色谱柱(如Shim-PackSCR-101P)

  为了获得尖峰可以使用这种类型的列,分析柱的温度必须设置接近80℃。因此,即使流动相瓶中的溶解空气处于饱和溶解度,气泡也很容易在柱出口附近或下游形成。如果发生这种情况,(1)提前进行在线脱气以降低溶解的空气水平或(2)施加背压以抑制气泡的形成。然而,对于测量(2),折射计不能承受很大的背压。如果传输水0.8 mL/min,然后假设限制0.3毫米的直径×50厘米(相当于0.04 MPa或0.4 kgcm-2)(假设没有堵塞,流经样品室)的解决方案。在这种情况下,在折射计之前安装一个节流管。

  典型分析条件如下:

  Column: Shim-packSCR-101P (7.9 mm I.D. × 300 mm L)

  Mobile Phase:Water

  Flow_rate: 0.8mL/min

  ColumnTemperature: 80 °C

  Detector: RID-6ARefractive Index Detector (with temperature control ON and sensitivity of 2 ×10-6 RIUFS)

  如果只用水作为流动相,溶解空气含量的波动对折射率的变化影响不大。因此,如果检测池内没有形成气泡,那么配体交换柱可能可以用于上述灵敏度水平,而无需严格的脱气。

  ii) 正相色谱柱(如Shim-packCLC-NH2)

  典型分析条件如下:

  Column: Shim-packCLC-NH2 (6 mm I.D. × 150 mm L)

  Mobile Phase:Acetonitrile/water (7/3)

  Flow_rate: 1.2mL/min

  ColumnTemperature: Room temperature

  Detector: RID-6ARefractive Index Detector (with temperature control ON and sensitivity of 8 ×10-6 RIUFS)

  在这些条件下,在准备流动相时要特别小心。在梯度体系中,乙腈与水的混合输送比例不固定,需要加热搅拌(1)(如5-1所述)。对于分析过程中的在线脱气,应采用密封加压的氦气净化系统。如果可能的话,最好保持恒温。分析2×10 -6 RIUFS可能需要在一个恒温控制的房间。

  下一个要考虑的问题是加热柱(或者更具体地说,抑制温度的微小变化)。柱温随室内空气流动而略有波动。因此,这改变了-NH2基团周围水层的厚度,改变了柱洗脱液中的乙腈/水比例。在这种情况下,用三层汽泡纸(图38)或使用其他方法来防止色谱柱暴露在直接气流中,并抑制任何温度变化。

  即使柱温箱开着,柱的位置等因素也会使柱暴露在风扇气流水平的变化中。这也适用于反相柱。

  最后评论

  正如我们所看到的到目前为止,流动相适当的脱气是一种有效抑制溶解在流动相中的气体造成的各种问题的方法,如在流路中形成气泡或由于溶解空气(或氧气)水平的变化对检测器造成不利影响。

  直到最近,人们还普遍认为,用抽滤器除气,如引言所示,应该总是进行脱气,但正如这篇文章所指出的,还有许多注意事项。因此,目前使用气液分离膜进行真空脱气已经非常流行,而氦气脱气用于更严格的脱气应用。

  在某些特定的分析条件下,脱气流动相甚至会导致样品溶剂中溶解空气出现峰值。

  我希望这篇文章将有助于所有的高效液相色谱用户选择和使用适合他们用途的脱气方法。

            

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